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細胞凍存操作步驟

更新時間:2019-03-04 點擊次數:3068
 操作步驟
(一)細胞凍存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養液;
2. 取對數生長期的細胞,去除舊培養液,用PBS清洗。
3. 去除PBS,加入適量胰蛋白酶(覆蓋培養皿表面)把單層生長的細胞消化下來;
4. 離心1000rpm,5min;
5. 去除胰蛋白酶,加入適量配制好的凍存培養液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數,調節凍存液中細胞的終密度為5×106/ml~1×107/ml;
6. 將細胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml;
7. 在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者;
8. 凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內。
(二) 細胞復蘇
1. 從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃溫水中,并不時搖動令其盡快融化。
2. 從37℃水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細胞懸液,加到離心管并滴加10倍以上培養液,混勻;
3. 離心, 1000rpm,5min;
4. 棄去上清液,加入含10%小牛血清培養液重懸細胞,計數,調整細胞密度,接種培養瓶,37℃培養箱靜置培養;
5. 次日更換一次培養液,繼續培養。
 

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